质粒纯化需要注意的要点有哪些呢?
2024-02-29
质粒是小的环状超螺旋双链 DNA，在宿主细胞内独立于染色体外自主复制并稳定遗传，可通过基因工程改造接入外源 DNA 作为基因载体，转入宿主细胞。如今，质粒已成为生物制药领域中最重要的工具之一，可用于克隆，扩增和表达目的蛋白；也可用于病毒载体和 mRNA 的生产等领域。质粒纯化是大多数分子生物学实验室的常用技术。虽然标准的碱裂解方法已经很成熟，但仍然可能出现令人惊讶的问题。那么，你知道质粒纯化需要注意的要点有哪些呢?一起来探究一下吧！
忽略质粒的拷贝数
同一大肠杆菌母株的质粒产量可能因多种因素而有很大差异。然而，质粒的复制起点将发挥重要作用，因为它将决定每个大肠杆菌细胞的质粒拷贝数 。因此，根据质粒的拷贝数，可能需要扩大质粒制备规模或进行多次质粒制备，以获得足够的质粒DNA供下游应用使用。
忘记在培养物中添加抗生素
如果忘记在培养物中添加抗生素或添加太少，则可能导致质粒丢失。确保仔细检查培养物中抗生素的浓度。
忽略透气重要性
大肠杆菌培养物通常在瓶中生长，需要适当的通气才能实现最佳生长。通常需要以 200-250rpm的速度摇动培养物。此外，考虑通过最小培养物与空气体积比约为 1:5 来增加培养物通气，使用棉塞或透氧膜等确保培养物获得足够的通气。
过量培养
另一种情况是越多并不是越好，如果培养生长时间过长会导致基因组DNA污染。最好在接种后约 12-18 小时处理细胞。
测量OD600
OD600是估算培养物密度的好方法，以便您知道何时处理细胞。由于高光密度无法测量，因此取一份培养物，稀释十倍并使用标准分光光度计进行测量。培养物已准备好以0.2-0.35的OD600处理十倍稀释的培养物。
不要超出负载
许多质粒制备试剂盒都附带有关培养条件的建议。请仔细遵循这些步骤，以确保裂解纯化柱不会过载。添加过多的培养物肯定会降低裂解物的质量、堵塞纯化柱并降低纯化性能。
操作要清柔
正确纯化质粒的关键之一是将基因组DNA与质粒DNA分离。可以通过移液或涡旋将细菌沉淀重悬于P1缓冲液中。然而，在裂解过程中不能过度混合，因为您可能会剪切基因组DNA，而基因组DNA会与柱基质结合并污染您的质粒。
忽略裂解时间
有些人可能认为裂解时间越长越好，然而大肠杆菌的碱裂解时间过长会产生大量非质粒碎片。此外，不同菌株的大肠杆菌对碱裂解的敏感性也不同。最重要的是，裂解时间过长可能会导致质粒 DNA 变性，从而导致制备质量差。
完全中和裂解物
添加中和溶液并与裂解液混合后，不要立即进行下一步！中和不完全可能导致制备质量差。确保多次翻转试管以确保裂解物完全中和。即使观察到大的蓬松沉淀物，也需要多一点时间以确保溶液完全混合。
防止细胞碎片杂质
中和步骤后，许多质粒制备物需要离心以将 DNA 与细胞碎片分离，从而澄清裂解物。在此步骤中，重要的是要缓慢进行，并避免将不必要的细胞碎片转移到下一步，这可能会干扰结合和/或降低纯度。
记得添加酒精
许多质粒制备试剂盒包含使用乙醇的洗涤缓冲液。这些缓冲液通常为浓缩液，使用前必须用乙醇稀释。这是一个常见的错误，经常被遗忘并导致准备失败。另外，不要忘记确保拧紧盖子以防止乙醇蒸发。
P2加热缓冲液
下游转化问题的一个常见原因是盐和蛋白质的污染。确保每次纯化后测量A 260/A280和A260/A230比率，高于1.8的比率通常被认为是纯净且不含污染物的。
不要一次处理太多样品
虽然可以最大限度地提高时间效率，但质粒纯化中的某些步骤对时间敏感。不要尝试一次处理太多样本，否则某些准备工作可能会放置太久而失效。
不要忘记热洗脱
如果质粒>10 kb，请考虑使用加热至50°C的洗脱缓冲液，以提高从柱基质上洗脱的效率。此外，离心前可以将洗脱缓冲液留在柱上5-10分钟。
以上就是小编总结的质粒纯化需要注意的要点，如果你有更多补充请咨询百奥创新客服！
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